液壓撞擊傷后神經元內游離氫的變化及其影響因素張相彤劉恩重劉曉謙蘇君武俏麗戴欽舜] i）的變化，探討尼莫地平（Nim）、D2 氨基戊酸（DAP5）和亞低溫對創傷后神經元內[ H ] i變化的影響及機制。方法以BCECF AM為細胞內氫離子的熒光指示劑，用激光共聚焦顯微鏡測定液壓撞擊傷時體外培養的大鼠神經元內[ H ] i的變化。結果液壓撞擊傷后腦皮質神經元[ H ] i于傷后于傷后4 h內應用可降低[ H ] i，而DAP5于傷后10 h之內應用有效，亞低溫于30 min內應用可降低細胞內[ H ] i的效果優于Nim（P 0 .001）。結論液壓撞擊傷致神經元內酸中毒， Nim、DAP5和亞低溫均降低細胞內] i，但各自作用的有效時間窗不同，揭示對創傷后神經元酸中毒應注意綜合治療，并選定各自作用的最佳時間窗。

　　作者單位：150001哈爾濱醫科大學第一附屬醫院神經外科（張相彤現在北京市神經外科研究所病理生理研究室，100050）腦創傷是當今青少年致死致殘的重要原因之一。腦創傷后的神經組織損傷除原發機械損傷外，其所繼發的病理損害更為引人注目。這些繼發的病理損害與腦創傷后神經生化反應密切相關，其中包括細胞內酸中毒。了解創傷后神經細胞內酸中毒形成機制，對創傷預后改善有著重要意義。筆者著重研究尼莫地平（Nim）、D 2 氨基戊酸（D AP 5）和亞低溫對創傷后神經元細胞內[ H ] i的影響，并分析其可能作用機制。

　　材料與方法1.細胞培養：取新生Wistar大鼠104只大腦皮層組織，分散成單細胞懸液，接種于50 ml培養瓶中的預先洗滌有多聚賴氨酸（美國Sigma公司）的蓋玻片上，送入含體積分數為培養箱37℃培養，培養液為含有體積分數為10 的胎牛血清的RPMI1640.經8～14 d的原代培養后進行研究。神經元烯醇化酶（NSE）免疫組化染色顯示40陽性，膠質細胞纖維酸性蛋白（GFAP）免疫組化染色顯示60陽性。

　　2 .液壓撞擊傷實驗：液壓撞擊傷裝置參考Scott等模型，沖擊壓力為2 .5kPa，作用時間為20～30 ms.

　　3 .實驗分組：（1）正常對照組。（2）創傷組：又分為創傷治療，觀察2 h后對細胞內[ H ] i的影響。以上各實驗組鼠數均為8只。

　　4 .神經元內[ H ] i的測定：在蓋玻片上培養的神經元，經磷酸緩沖液（PBS）沖洗3次后，于37℃條件下用小室上，用Insight plusIQ激光共聚焦顯微鏡488 nm氬離子激光激發，記錄530 640 nm發射熒光，求二者之比。根據標準曲線求出細胞內pH值。

　　直接標定細胞內pH值求標準曲線：配制高鉀緩沖液，nm）細胞內BCECF的激發熒光比值，求出該比值與pH值的標準曲線。

　　5 .統計學處理：結果采用SAS軟件系統處理，以x±s表示，組間比較采用雙樣本異方差t檢驗進行統計學分析。

　　結果1 .液壓撞擊傷后神經元內[ H ] i的變化：與正常對照組相比較，傷后0 .25 h神經元內[ H ] i即已逐漸升高，于傷后12 h達高峰，隨后[ H ] i逐漸下] i的變化2 .Nim、D AP 5和亞低溫對液壓撞擊傷后神經元內[ H ] i變化的影響：Nim治療組于傷后4 h內應用可抑制細胞內[ H以上應用則無效（P 0 .05）。D AP 5治療組于傷后4 h內應用明顯抑制[ H以上則無效（P 0 .05）。亞低溫治療組在傷后0 .5 h內可降低[ H細胞內[ H見圖2.

　　] i的影響討論酸中毒是顱腦創傷繼發性病理損害過程的一個重要方面。因此，直接檢測細胞內[ H ] i是深入探討腦創傷時神經生化變化的重要手段之一。以往的研究主要采用生化分析血漿中乳酸含量或采用微透析技術監測腦組織細胞外液中乳酸含量等方法間接反應腦組織酸中毒。筆者采用細胞內H熒光探針BCECF AM直接檢測腦液壓撞擊傷后不同時間單個神經元胞漿中[ H ] i水平的變化，發現腦創傷后神經元存在酸中毒。傷后0 .25 h細胞內[ H ] i即已升高，并于12 h達高峰，以后逐漸下降，48 h仍維持較高水平。這種腦創傷后神經元胞體[ H ] i升高的原因尚未完全明確，可能與以下兩方面有關：（1）腦創傷后神經元內K大量外流，從而導致細胞膜去極化，而這種去極化又可誘導興奮性氨基酸（EAA）的釋放，而進一步促進K外流，同時Ca內流，這樣在離子跨膜異常與EAA釋放之間形成一種惡性循環。神經元為了維持細胞內外正常離子平衡，這種異常跨膜離子障礙激活能量依賴性離子泵及刺激ATP水解增加，最終使糖酵解增強，結果導致乳酸堆積，細胞內酸中毒形成。（2）腦創傷后γ氨基丁酸（GABA）釋放可激活Cl通道，從而使HCO外流同時谷氨酸釋放激活N 甲基D 天門氡氨酸（NMDA）受體，從而H內流，這樣形成細胞外液短暫堿性化。這種細胞外液短暫堿性化、細胞內H升高及膜去極化均可激活Na交換泵。此外，腦創傷后與EAA受體耦聯的蛋白激酶C（PKC）也可被激活，從而使Na交換泵磷酸化而激活交換泵間接依賴Na泵直接依賴于Na ATP大量消耗，一方面產生H，另一方面刺激無氧糖酵解增強，最終產生乳酸堆積，細胞內酸中毒。可見EAA受體的激活和Na泵與Na泵的激活是乳酸堆積的一個重要來源。

　　腦創傷后神經元細胞膜去極化，電壓依賴性鈣通道開放，而尼莫地平特異性阻斷該通道開放，從而減輕跨膜Ca異常分布，進而減少Ca泵對ATP的消耗，最終使H產生減少及糖酵解作用減弱。此] i競爭細胞內蛋白結合位點，內流減少從而使[ H ] i減少。本實驗結果顯示，尼莫地平于創傷后4 h內應用有效，10 h以上則無效。這說明腦創傷后早期Ca內流很可能以電壓依賴性通道為主，而晚期可能以受體依賴性通道激活的NMDA受體數目減少，從而減少Ca內流及K外流，恢復跨膜離子異常紊亂降低糖酵解，進而減少[ H ] i的升高。筆者采用NMDA受體競爭性拮抗劑D AP 5 ，在創傷后4 h內應用最佳，4～10 h內應用效果欠佳， 22 h以上應用則無效。這說明EAA釋放主要在傷后10 h內，而10 h以上一方面由于EAA釋放減少，另一方面由于其他生化級聯反應（如花生四烯酸等）形成有機酸增多，并且細胞內Ca超載、自由基形成、酸中毒等相互影響，最終使創傷后期酸中毒形成不單一局限于EAA受體所介導的離子紊亂這一因素。亞低溫治療保護作用主要通過以下幾方面降低[ H制EAA釋放（2）減少ATP消耗[ 8]，從而一方面減少H生成，另一方面減少刺激糖酵解增強（3）抑制PKC的活性[ 9]，從而使PKC磷酸化G 蛋白受體抑制，進而控制Na內流，減輕跨膜離子紊亂，最終使糖酵解減弱。筆者觀察亞低溫治療組傷后0 .5h內應用有效，而1 h以上應用則無效。其原因可能是傷后1 h以上，EAA釋放增多，而且PKC已被激活，ATP消耗增加，最終導致亞低溫傷后1 h以上應用無效。

　　本實驗結果表明，Nim、D AP 5和亞低溫從不同機制保護創傷后神經元，且有效治療時間窗不同。提示臨床上對創傷后神經元酸中毒應注意綜合治療，并選定各自作用最佳時間窗。本實驗建立于細胞水平的創傷模型，至于整體水平上效果如何，還需要進一步研究。